Как доказать наличие кислорода в сосуде

В 2019 году Нобелевскую премию по физиологии или медицине присудили за исследования реакции клеток на нехватку кислорода. Трое лауреатов — два американца и один британец — в течение десяти лет по крупицам восстанавливали механизм того, как клетки ведут себя в стрессовой ситуации и как они посылают сигнал бедствия наружу, в кровь и окружающие ткани. Попутно выяснилось, что эти сигналы тревоги можно как искусственно подавить — и лечить таким образом рак, так и усилить — и избавить людей от нехватки кислорода, а еще — дозировать, управляя судьбой отдельно взятых клеток. Отсутствие кислорода оказалось не менее важно для жизни организма, чем его присутствие.

Открытие для учебников

Хотя премия, по традиции открывающая Нобелевскую неделю, и присуждается «за открытия в области физиологии или медицины», отмечаемые ею исследования, как правило, нельзя однозначно отнести к одной из этих областей. Каждый раз речь идет о какой-то проблеме на стыке фундаментальной и прикладной науки, и, должно быть, Нобелевскому комитету нелегко год за годом удерживать это равновесие.

В 2017 году весы склонились в сторону теории: премия досталась группе ученых, исследовавших молекулярный механизм биологических ритмов (подробнее об этом — в нашем материале «Ход часов лишь однозвучный»). Несмотря на то, что темой внутриклеточных часов в последнее время интересуется множество научных коллективов, до реальных лекарств, которые могли бы скорректировать их ход, ученые пока не добрались.

В 2018 году маятник предсказуемо качнулся в другую сторону: иммунные чекпоинты — механизмы торможения иммунной агрессии, открытые прошлогодними лауреатами премии, оказались интересны, в первую очередь, с практической точки зрения. На основе этих исследований уже разработаны препараты, способные, наоборот, «подгонять» иммунитет и «натравливать» его на опухолевые клетки. К моменту присуждения награды Шведской академии в прошлом году некоторые из них уже применяли на практике (мы писали об этом в материале «Спустить собак с цепи»).

В этот раз стоило ожидать очередного решения в пользу фундаментальной науки, и оно было принято. Премию присудили за открытие механизмов, позволяющих клетке чувствовать нехватку кислорода, реагировать на нее и сигнализировать об этом соседям. У этого открытия есть, конечно, и прикладное значение: на его основе уже созданы препараты для борьбы с анемией и раком, и сегодня они находятся на разных этапах клинических испытаний.

«Неужели премию снова дали за лекарство от рака?» — спросите вы. На самом же деле лекарство от рака — лишь один из частных случаев применения нового открытия, тогда как само по себе оно гораздо глубже. «Ученые часто шутят по поводу “открытия, которое войдет в учебники”, — прокомментировал решение Нобелевского комитета один из его членов, Рэндал Джонсон. — Но сейчас я бы сказал, что мы действительно имеем дело с открытием для учебников. Наши дети будут проходить его на уроках биологии с 12 лет».

Сигнал тревоги

О том, что кислород необходим для существования большинства организмов на Земле, в школьных учебниках пишут уже давно. Рассказывают и о том, как кровеносная система регулирует работу дыхания, — за это открытие Нобелевскую премию присудили еще в 1938 году. В сонной артерии есть скопления чувствительных клеток, реагирующих на концентрацию кислорода в крови. Если она снижается, то эти клетки выбрасывают нейромедиаторы, заставляющие легкие дышать активнее, а сердце — биться быстрее.

В 1980-х годах обнаружилось, что количество кислорода в крови небезразлично еще и почкам. Как только его становится недостаточно, почки выделяют гормон эритропоэтин. Он действует на красный костный мозг, ускоряя образование эритроцитов, чтобы в кровь «помещалось» больше кислорода.

Эритропоэтин выделяется, например, когда человек поднимается высоко в горы, где воздух разрежен и содержит меньше кислорода. Сейчас его иногда используют в качестве допинга спортсмены, чтобы повысить емкость крови и усилить газообмен. Но иногда эритропоэтина не хватает, например при почечной недостаточности, и тогда у человека развивается анемия — в крови снижается число эритроцитов, а клетки задыхаются без кислорода.

Продолжая исследования своих предшественников, Грегг Семенца (Gregg Semenza) из Университета Джонса Хопкинса занялся изучением гена эритропоэтина (EPO). Он пытался вычислить недостающее звено между концентрацией кислорода и работой (экспрессией) гена ЕРО. Семенца искал регуляторную область, которая запускает экспрессию гена в ответ на гипоксию.

В 1991 году поиски увенчались успехом: искомой областью оказался маленький участок перед началом гена. В то же время сэр Питер Рэтклифф (Peter Ratcliffe) из Оксфорда независимо пришел к тому же выводу: он показал, что если ген ЕРО вместе с этим небольшим регуляторным участком пересадить в клетки опухоли печени, то они тоже начинают производить эритропоэтин в ответ на кислородное голодание.

Два года спустя Семенца выделил белковый комплекс, запускавший работу ЕРО, и назвал его HIF — hypoxia-inducible factor, то есть фактор, индуцированный гипоксией. А потом оказалось, что HIF связывается с ДНК во всех клетках человеческого организма. В 1993 году группа Семенцы одновременно с коллективом Рэтклиффа обнаружила, что в любой клетке экспрессия генов изменяется при гипоксии. Сейчас известно около 300 генов, работа которых зависит от концентрации кислорода.

Дальнейшие исследования Семенцы показали, что комплекс HIF состоит из двух частей: одна (ARNT) не зависит от кислорода и работает как переносчик, доставляющий весь комплекс в ядро, а другая появляется в клетке только при гипоксии. Эту белковую часть назвали HIF-1a. Позже выяснилось, что она существует в клетке в нескольких видах: есть еще HIF-2a (который чаще называют EPAS1) и даже HIF-3a.

Сейчас мы знаем, что разные варианты HIF отвечают за разную реакцию на кислород. Например, выделение эритропоэтина в почках регулирует HIF-2a — он работает при хронической, длительной гипоксии. А HIF-1а служит краткосрочным сигналом тревоги, он действует при острой гипоксии и может затормозить деление клетки или даже вызвать ее смерть (апоптоз).

Таким образом, к 1995 году в общих чертах стало понятно, как HIF работает в клетках: с какими последовательностями в геноме связывается и на какие гены действует. Было также ясно, что количество его в клетке может меняться и, судя по всему, иногда его разрушает протеасома — внутриклеточная молекулярная машина для уничтожения отживших свое белков. Однако исходная проблема оставалась нерешенной: по-прежнему было не ясно, как белковый комплекс HIF связан с концентрацией кислорода.

Игры с совестью

В 1995 году Уильям Кэлин (William Kaelin) из Института рака Дана-Фарбер занимался загадкой болезни Гиппеля-Линдау. Это редкое генетическое заболевание, которое встречается примерно один раз на 36 тысяч новорожденных, а проявляется как склонность к развитию опухолей — гемангиобластомы, ангиомы, почечной карциномы и других.

Кэлин доказал, что причиной болезни является мутация в гене VHL (von Hippel-Lindau-supressor). Он также заметил, что в отсутствие белка VHL в клетках начинали работать те же гены, что и при гипоксии.

В то время уже было известно, что VHL может быть как-то связан с протеасомами. А в 1999 году обнаружилось, что VHL и HIF могут взаимодействовать, но только в присутствии кислорода. И пару лет спустя Рэтклифф и Кэлин независимо друг от друга нашли между ними связь.

Оказалось, что в клетке есть ферменты — пролил-гидроксилазы, использующие кислород, чтобы навесить на HIF дополнительные ОН-группы. После этого белок HIF меняет свою форму и лучше связывается с белком VHL, который тащит его на верную «смерть» в протеасому. В отсутствие кислорода вся эта цепочка не работает, HIF «остается в живых» и отправляется в ядро, чтобы повлиять там на экспрессию генов. Пазл сложился.

Этапы ответа на гипоксию. 1. HIF запускает работу генов-мишеней в ядре. 3. В присутствии кислорода пролилгидроксилазы навешивают ОН-группы на HIF. 4. Белок VHL cсвязывается с измененным HIF и направляет его в протеасому. 2. Протеасома расщепляет HIF.

После того как ученым удалось собрать воедино весь каскад, с помощью которого клетка отвечает на отсутствие кислорода, стало понятно, что опухоли могут использовать его в своих целях. Ведь раковым клеткам, чтобы расти, необходимы кислород и питательные вещества, а следовательно, требуются сосуды. Многие опухоли буквально «паразитируют» на белке HIF: они заставляют его работать постоянно, клетки раз за разом подают сигнал тревоги и вызывают рост сосудов в окружающей ткани.

Именно это, в частности, происходит у пациентов с болезнью Гиппеля-Линдау: сломанный белок VHL оказывается не в силах уничтожить HIF, и клетки снова и снова «прикидываются» страдающими от кислородного голодания, пока вся опухоль не прорастет сосудами.

Сегодня открыты сразу несколько способов заглушить этот мнимый сигнал тревоги. Вещества, блокирующие работу HIF на разных стадиях, от построения белка до перемещения в ядро и связывания с ДНК, фактически работают как «внутриклеточная совесть» и тормозят рост раковых клеток.

Многие из этих веществ сейчас находятся на разных стадиях клинических испытаний. Их тестируют как в одиночку, так и вместе с другими методами лечения опухолей: блокада HIF мешает раковым клеткам пережить стресс от радио- или химиотерапии.

Но есть ситуации, когда совесть становится слишком суровой и не дает клеткам подать сигнал тревоги — например, у пациентов с почечной недостаточностью или анемией. В их случае необходимо, наоборот, усилить работу HIF. Для этого сейчас существуют препараты, блокирующие пролилгидроксилазы и не дающие им в присутствии кислорода навесить роковую метку на HIF. В настоящее время они тоже проходят клинические тестирования, большинство из них — уже в третьей фазе, а значит, скоро могут появиться на рынке.

Дырка от бублика

Но работы нобелевских лауреатов этого года дали нам больше, чем рецепт очередного лекарства от рака и средства от анемии. Свое главное открытие они совершили еще в начале пути, в 1993 году, когда выяснили, что каждая клетка организма реагирует на дефицит кислорода по-своему.

До этого считалось, что это зона ответственности небольшого количества клеток в специализированных органах — почках и стенках сосудов. На самом же деле, кислород имеет значение не только в масштабах целого организма, но и для судьбы каждой клетки в отдельности.

Мы уже упоминали, что в зависимости от силы стресса и длительности кислородного голодания клетка может погибнуть или, наоборот, начать производить факторы роста сосудов. Небольшой стресс может работать как позитивный стимул, «встряска», заставляющая клетку размножаться и дифференцироваться.

За то время, что прошло с момента открытия HIF, ученые обнаружили у гипоксии множество неожиданных последствий.

Известно, например, что в период эмбрионального развития некоторые группы клеток оказываются зажаты между другими — и в этот момент под действием гипоксии они превращаются в будущие хрящи.

Нехватку кислорода используют как один из факторов дифференцировки для выращивания предшественников нейронов или клеток стенки сосудов.

Есть даже работы, показывающие, что под действием ингибиторов пролилгидроксилаз, то есть в условиях повышенной активности HIF, у мышей лучше регенерируют ткани. А в одном исследовании с помощью такой же активации HIF удалось улучшить память у здоровых мышей.

Таким образом, получается, что нехватка кислорода может не только угрожать жизни клеток, но и служить двигателем клеточной судьбы. В некоторых случаях гипоксия, этакая дырка от бублика, оказывается выгоднее самого бублика — например, когда речь идет о регенерации.

Все эти эксперименты пока не вылились ни в какие конкретные клинические разработки, однако они напоминают нам, что в устройстве внутриклеточной сигнализации остается еще немало белых пятен. Главной заслугой Уильяма Кэлина, Питера Рэтклиффа и Грегга Семенцы стало то, что они закрасили одно из них, открыв попутно новое поле для исследований клеточной судьбы.

Мы привыкли считать, что Нобелевские премии присуждают за давние, почти забытые открытия, которые наконец-то прошли проверку временем. На самом же деле, как и многие предыдущие работы, отмеченные Нобелевским комитетом, исследования гипоксии находятся еще только в середине пути. Настоящее применение и настоящее признание ждет их впереди.

Полина Лосева