Семя быков в сосуде дьюара

Широкое применение нашел метод замораживания и длительного хранения спермы быков в жидком азоте (-196°). Замороженную сперму можно доставлять в хозяйства 1—2 раза в год и использовать ее по мере надобности. Один раз в месяц сосуды, в которых содержится сперма, необходимо пополнять жидким азотом. На племпредприятиях (станциях) по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных сперму замораживают при помощи специального оборудования (приборов, аппаратов и т. д.) и хранят в стационарных емкостях, находящихся в хранилищах станций (филиалов). Отсюда ее отправляют в обслуживаемые хозяйства. Для замораживания спермы на племпредприятиях (станциях) применяют следующие методы. Метод двухмоментного разбавления и трехступенчатого режима замораживания спермы быков при помощи специальных аппаратов (АХК-4, ПЗСС и др.). К замораживанию допускают сперму с подвижностью спермиев не ниже 8 баллов и их концентрацией не менее 0,8 млрд. в 1 мл. Затем сперму разбавляют глюкозо-цитратно-желточной средой (35—37°) двухмоментно: сначала без глиперина, а спустя 4 ч после охлаждения к разбавленной сперме путем подслаивания добавляют такую же среду, имеющую температуру плюс 2—5° и содержащую 16% глицерина. Сперму в глицеринизированной среде выдерживают в бытовом холодильнике 6—12 ч при температуре 2—5° После эквилибрации (уравновешивания) проверяют подвижность спермиев (она должна быть не ниже 7 баллов), расфасовывают в стеклянные или полиэтиленовые ампулы по 1—1,2 мл. Ампулы запаивают и вкладывают в емкости, которые помещают в аппараты для замораживания. Замораживают сперму по трехступенчатому режиму со следующей скоростью: от 0 до 15° по 0.5—Г в 1 мин, от 15 до 50° по 2—3° в 1 мин и от 50 до 80° по 5—7° в 1 мин, после чего емкости (канистры) переносят в жидкий азот для хранения.

Перед осеменением ампулу со спермой оттаивают в ванночке с водой температурой 38—40° в течение 45—60 с. Подвижность спермиев после оттаивания должна быть не ниже 4 баллов. Метод одномоментного разбавления и бистрого замораживания спермы в форме гранул. В качестве разбавителей используют синтетические среды № 1 и 2. К разбавителям добавляют нетоксичный стрептомицин из расчета 1 г на 1000 мл жидкости. Свежеполученную сперму (после оценки) разбавляют средой № 1 в отношении 1:1, при этом концентрация глицерина в разбавленной сперме будет 3,5%; если качество спермы позволяет, ее дополнительно разбавляют средой № 2. При определении степени разбавления спермы для замораживания учитывают, что в одной грануле объемом 0,1 мл после оттаивания должно содержаться не менее 20—25 млн. подвижных спермиев. После разбавления сперму помещают в ванночку с водой, температура которой равна температуре спермы, и переносят на 30 мин в холодильник. При этом следят, чтобы сперма и вода охлаждались не быстрее 1° в минуту. Затем сперму при температуре 5° эквилибрируют в течение 5—5 ч. Для приготовления гранул берут блок сухого льда (двуокись углерода) и на его поверхности специальным нагревательным прибором (к электроутюгу прикрепляется пластина с выступами) делают лунки диаметром 5—7 мм. В каждую лунку 2-миллиметровым шприцем вносят по две капли спермы. Величина гранул должна быть 0,1 мл.

После 5—10-минутной выдержки на поверхности сухого льда гранулы высыпают в сосуд (кружку) с жидким азотом. Гранулы со спермой разных быков высыпают в отдельные емкости. Сперму быков (замороженную) в гранулах можно расфасовывать в специальные трубочки из белой жести с продольным разрезом или в алюминиевые тубы, на которых записывают специальным карандашом кличку быка, дату получения спермы и название племпредприятия (станции). В хозяйствах для оттаивания гранул используют специальный раствор (на 100 мл дистиллированной воды 2,9 г лимоннокислого натрия для инъекций, 0,1 г лимонной кислоты), поставляемый централизованно в специальных ампулах по 1 мл. Одна гранула растворяется в содержимом одной ампулы. Кроме замораживания спермы на сухом льду, в настоящее время широкое применение нашел метод замораживания спермы в форме гранул в жидком азоте при помощи специальных пластин.

Замораживание спермы в гранулах в жидком азоте на фторопластовых пластинах. После получения и оценки сперму быков разбавляют лактозо-желточной средой с глицерином следующего состава: вода дистиллированная — 100 мл, лактоза — 11,5 г, желток куриных яиц —20 мл, глицерин —5 мл. Для предупреждения развития микрофлоры в сперме к среде добавляют препарат спермосан-3. Перед разбавлением среду подогревают до 30—35°. Этой средой сперму быков разбавляют в 2, 10 раз и более, в зависимости от объема гранул. Если применяют концентрированные гранулы спермы объемом по 0,1— 0,2 мл, то для них требуются меньшие степени разбавлении. На пункте искусственного осеменения гранулы спермы по 0,1—0,2 мл дополнительно разбавляют. Для этого их перед осеменением коров оттаивают во флаконе с 1 мл 2,9%-ного раствора лимоннокислого натрия, подогретого до температуры 38—40°. Для замораживания спермы в гранулах объемом 0,5—1,0 мл сперму разбавляют в 10 раз и более. Такие гранулы перед осеменением коров не требуют дополнительного разбавления. Если гранулы объемом 0,5 мл, то перед осеменением коров берут две гранулы, помещают их в стерильный флакон или пробирку и погружают в теплую воду (38—40°) для оттаивания.

Для замораживания сперму после разбавления охлаждают до температуры 2—4° в течение 4—5 ч, а затем разливают градуированными пипетками, шприцем или разливочной машиной в лунки (0,1—0,2 или 0,5 мл) охлажденной в жидком азоте фторопластовой пластины. Пластину со спермой выдерживают над поверхностью жидкого азота на расстоянии 5—10 см в течение 1,5—2 мин, а затем погружают ее в жидкий азот на 1—2 мин. После замораживания спермы пластину вынимают из жидкого азота, гранулы спермы собирают в сачок или контейнер, а затем пересыпают их в охлажденные чашки. На пунктах искусственного осеменения гранулы спермы хранят в сосудах Дьюара. Уровень азота в них должен быть значительно выше чашек с замороженной спермой в гранулах. Перед осеменением гранулы спермы из чашек достают охлажденным до —196° пинцетом, оттаивают их, производят Оценку активности спермиев и используют для осеменения коров при активности спермиев не ниже 4 баллов. Предметное стекло кладут на столик микроскопа, нагревают сперму до температуры 40° в термостате или на обогревательном столике и определяют подвижность спермиев. Для дальнейшего хранения допускается сперма, имеющая подвижность спермиев не ниже 4 баллов. Метод замораживания спермы в облицованных гранулах. По этому методу для замораживания используют свежеполученную сперму, разбавленную средами ,”° 1 н № 2 следующего состава.

Среда № 1. 11%-ный раствор лактозы или сахарозы       63 мл
Желток куриных яиц          30 мл
Глицерин                              7 мл

Среда № 2. Вода дистиллированная 100 мл
Лактоза или сахароза              6 г
Натрий лимоннокислый трехзамещенный пятиводный1,4 г
Глицерин                              5 мл

Приготовленные среды наливают в стерильные полиэтиленовые емкости по 200—400 мл, которые подсоединяют к специальному устройству для разбавления спермы. После получения спермы ее разбавляют средой № 1 в соотношении 1 : 1 и выдерживают при комнатной температуре 5—10 мин. Затем проводят дополнительное разбавление спермы средой № 2 до требуемой концентрации (20—25 млн. в дозе). Сперму разбавляют с помощью специального устройства, позволяющего дозирование вводить среды в отделенную часть одноразового полиэтиленового спермоприемника со спермой. Спермоприемник соединяют с тонкостенной полимерной трубкой и выдавливают в нее разбавленную сперму. Заполненную спермой трубку разделяют с помощью автомата АРС-2 на отдельные дозы по 0,33 мл с их герметизацией. Облицованные (герметизированные) гранулы помещают в алюминиевые контейнеры, которые закрывают пробками. Контейнеры закрепляют в обоймы специального устройства для эквилибрации и замораживания спермы. Это устройство помещают в холодильник для охлаждения до 2—5°. После 5—6-часовой выдержки при такой температуре обойму аппарата с контейнерами погружают в емкости с жидким азотом на 8—10 мин.

Активность спермиев после замораживания спермы проверяют спустя 24 п. Из каждого контейнера берут по одной грануле и опускают в воду с температурой 40° для оттаивания. Гранулу вытирают марлевой салфеткой, с помощью ножниц ее вскрывают и определяют активность спермиев. Для дальнейшего хранения допускают сперму с активностью не ниже 4 баллов. Для замораживания спермы в необлицованных гранулах ее после охлаждения и эквилибрации накапывают на фторопластовую пластину непосредственно яз спермоприемника.

Замораживание спермы в соломинках (пайеттах). При замораживании используют полипропиленовые или поливинилхлоридные трубочки длиной 100 мм с внутренним диаметром 2,4 мм, одни конец которых предварительно закрывают специальным герметизирующим составом: парафин ГОСТ 13577—12,0, пентаэритритовый эфир канифоли — 44,8, тальк — 10,1, каучук натуральный — 1,5, глицерин ГОСТ 6259—71—8,0, краситель — 0,1. Сперму разбавляют трисбуферной средой, содержащей 6,056 г трисбуфера (трисгидрооксиметиламн-нометан), 3,4 г лимонной кислоты, 2,5 г фруктозы, 166,3 мл бидистиллированной воды. Раствор делят на две равные части, к первой добавляют 15,8 мл бидистиллированной воды, 25 мл свежего яичного желтка, 100 тыс. ЕД антибиотиков, ко второй— 19,7 мл глицерина, желток и антибиотики в тех же количествах. Первый разбавитель добавляют к эякуляту, предварительно доведенному до температуры 25°. Вторую среду медленно добавляют к предварительно разбавленной сперме с таким расчетом, чтобы в соломинке (пайетте) содержалось 20—25 млн. подвижных спермиев. После разбавления сперму расфасовывают по 0,4 мл в стерильных условиях вакуумным способом. Для этого необходимое количество промаркированных соломинок (от 100 до 500 шт. в зависимости от количества спермы) ставят открытыми концами вниз в стеклянную плоскодонную посуду со спермой в помещают в анаэростат, из которого насосом вначале откачивают воздух до давления 0,95 атм., а затем впускают его.

Воздух нагнетает сперму в соломинку. Заполненные спермой пайетты зажимают в специальном держателе, при температуре 25° погружают в герметизирующий состав и закрывают второй конец. После герметизации соломинки помещают на медное сито (корзинку) и переносят в пары жидкого азота стационарного хранилища. Корзинку с соломинками опускают в хранилище до соприкосновения с поверхностью азота. Вскипание азота образует ток холодного газа, который охлаждает и замораживает сперму до 100—130° в течение 5 мин. Соломинки с замороженной спермой переносят в стаканчики, помещают в канистры и закладывают в хранилище с жидким азотом. Замороженную в соломинках сперму перед использованием оттаивают в стерильном полиэтиленовом мешочке, помещенном в теплую воду (38—40°) в течение 12—14 с. Независимо от метода замораживания сперму оттаивают и проверяют на подвижность спермиев сразу после замораживания, второй раз — через сутки, третий — через 7—10 дней и четвертый раз — через 14—20 дней. Замороженная сперма для дальнейшего хранения допускается при подвижности спермиев не ниже 4 баллов. Для оценки оттаянной спермы в пайеттах (выборочно) производят смешивание ее из одной соломинки с равным количеством изотонического раствора лимоннокислого или бикарбоната натрия. Для этого один конец соломинки обрезают ножницами и опускают в раствор, а затем этими же ножницами обрезают и второй ее конец. Полученную смесь спермы и раствора перемешивают соломинкой и с ее помощью берут каплю для оценки. Для осеменения используют сперму не раньше 14—20 дней после замораживания. Оттаявшую сперму вновь замораживать нельзя. Для оценки спермы, хранившейся при температуре 2—4°, каплю спермы наносят на предметное стекло и рядом с ней наносят каплю 2,9%-ного раствора лимоннокислого натрия или 1%-ного раствора бикарбоната натрия, затем обе капли, не смешивая, закрывают покровным стеклом.

Техника безопасности при работе с сосудами Дьюара
При работе с жидким азотом надо закрывать незащищенные участки тела, так как он вызывает обморожение. Работать следует в защитных очках или щитках из органического стекла, на руки надевать брезентовые (асбестовые, кожаные) рукавицы или перчатки. Незащищенный участок тела, на который попал жидкий азот, бистро обливают водой.
При заливке жидким азотом неохлажденного сосуда нельзя заглядывать в горловину сосуда, так как при этом может произойти выброс жидкого азота вследствие образования большого количества газа.
Повышение концентрации азота в воздухе вызывает головную боль, головокружение и потерю сознания. Поэтому помещения, где хранят жидкий азот, оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией. При обморочном состоянии пострадавшего немедленно выносят на свежий воздух.
Нельзя плотно закрывать сосуды Дьюара. При транспортировке сосудов с азотом их следует хорошо фиксировать. При перевозке автотранспортом сосуды заливают наполовину гидравлической емкости. Во избежание взрыва сосуды отогревают в изолированном помещении.
Для предотвращения накопления взрывоопасной смеси в емкости содержание кислорода следует контролировать с помощью переносного газоанализатора ГХП-3: в хранилищах—1 раз в год, на пунктах—1 раз в 6 месяцев. После накопления кислорода в количестве 15% сосуд необходимо опорожнить в месте, очищенном от предметов органического происхождения: дерева, бумаги, тряпок (особенно промасленных), навоза и пр.

Жидкий азот, в котором на пункте искусственного осеменения хранится доставленное семя племенных быков, имеет температуру минус 196°. Попадание жидкого азота на кожу тела техника по искусственному осеменению может привести к тяжелому обморожению. При небрежном отношении к жидкому азоту могут наступить тяжелые последствия. Учитывая это, специалист занимающийся работой с глубоко замороженным семенем должен строго соблюдать технику безопасности.

Правила техники безопасности:

1. Для защиты глаз от попадания брызг жидкого азота необходимо обязательно одевать очки (лучше автомобильные). Очки одевают при заправке сосуда Дьюара жидким азотом и извлечение из сосуда глубоко замороженного семени.

2. Все работы, которые специалисту приходится вести с жидким азотом необходимо проводить только в кожаных перчатках или рукавицах, которые легко можно сбросить взмахом кистей. Поэтому они должны быть свободными. Необходимость сбросить рукавицы или перчатки у специалиста возникает в том случае, если на них попал жидкий азот.

3. Если сосуд Дьюара имеет температуру окружающего воздуха (в начале использования или по другим причинам), то жидкий азот из транспортного резервуара заливают в него медленно. В это время категорически запрещается заглядывать в горловину сосуда для определения уровня жидкого азота. При быстром заполнение теплого сосуда Дьюара азотом, он может вылиться из сосуда из-за чрезмерного количества образующихся паров. Если азот переливают из одного сосуда в другой, то это делают мелкими порциями через 5-6 секунд. Жидкий азот в этом случае переливается с помощью широкой воронки.

4. В помещении пункта, где находится сосуд Дьюара с жидким азотом, обязательно должна быть форточка или помещение оборудуется принудительной вентиляцией. Не смотря на то, что азот является инертным газом, повышенное содержание его в воздухе уменьшает в последнем содержание кислорода. Поэтому пребывание в помещении пункта, где имеется повышенное содержание азота, вызывает головную боль.

5. Сосуды Дьюара для хранения замороженного семени в жидком азоте –двухстенные. Между этими стенками выкачен воздух – создан вакуум, за счет которого жидкий азот и сохраняется в сосуде более месяца. Сосуды Дьюара, которые потеряли вакуум, нельзя использовать в работе, т.к. хладоагент из них быстро испарится. Признаком потери вакуума является тонкий слой снега, которым обрастает сосуд в верхней своей части. Поэтому специалисты хозяйства должны в кратчайший срок заменить их на доброкачественные.

6. Техникам по искусственному осеменению категорически запрещается закрывать горловину сосуда Дьюара. Проникновение тепла из окружающего воздуха, вызывает испарение жидкого азота, что является нормальным процессом, за счет которого в сосуде создается низкая температура. При прекращении выхода испаряющегося азота из сосуда в атмосферу, давление внутри его повышается и сосуд может взорваться. Сосуды Дьюара следует закрывать специальными пробками с пазами, имеющимися для каждого сосуда. Если горловина сосуда обрастает льдом, то такие емкости к эксплуатации не допускаются, т.к. лед может вызвать закупорку сосуда и его взрыв.

7. При заливке сосудов Дьюара жидким азотом из транспортных резервуаров (ТРЖК) необходимо следить за тем, чтобы гибкий шланг был опущен до дна. Несоблюдение этого правила может привести к тому, что при случайном повышении давления в резервуаре, струя жидкого азота может выбросить конец шланга из горловины сосуда и облить стоящих рядом людей.

8. В практике искусственного осеменения обычно используют жидкий азот с примесью кислорода (около 4-5%). По этой причине в сосуде Дьюара на пункте может постепенно накапливаться жидкий кислород, т.к. температура сжижения его несколько ниже (-183°), чем у азота (-196°).Жидкий кислород может попадать в сосуд и из окружающего воздуха путем конденсации на внутренних стенках. По этой причине нельзя держать горловину сосуда открытой длительное время. Жидкий кислород, накапливающийся в сосуде Дьюара, взрывоопасен. Поэтому два раза в год сосуд необходимо опорожнять от остатков семени, накопившейся в емкости. Сливать обогащенную кислородом жидкость необходимо в безопасное место, очищенное от предметов органического происхождения: бумаги, дерева, навоза и, особенно, промасленных тряпок.

9. Лучше всего слив обогащенной кислородом жидкости производить во время очередной доставки жидкого азота на пункт искусственного осеменения. Одновременно производится и дезинфекция сосуда Дьюара путем ополаскивания его свежим жидким азотом, который практически стерилен. Перед опоражниванием сосуда, замороженное семя временно перегружают в запасной сосуд с жидким азотом.

10. Посещение пункта искусственного осеменения посторонними лицами категорически запрещен. Это делается во избежании заноса на пункт различных патогенных микроорганизмов.

При хранении семени на пункте искусственного осеменения необходимо иметь в виду, что микроорганизмы могут сохранятся в жидком азоте сосуда Дьюара. Отсюда они попадают на гранулы замороженного семени и с ним в половые пути коров, а это, как отмечалось выше, может стать причиной эмбриональной смертности зародышей. Отсюда техник по искусственному осеменению не должен допускать попадания микроорганизмов в жидкий азот.

Горловину сосуда Дьюара, не следует оставлять открытой. Перед замером уровня жидкого азота палку, с помощью которой это делается, обрабатывают спиртовым тампоном. Пинцет, которым техник по искусственному осеменению достает гранулы из сосуда, также должен быть стерильным. Сосуд Дьюара должен периодически обрабатываться.