Синтетические сосуды и клапаны сердца

Как разрабатываются искусственные клапаны сердца?

Научная концепция тканевой инженерии основана на идее заселения и выращивания живых клеток (фибробластов, стволовых клеток и др.) в синтетическом или естественном рассасывающемся каркасе (матрице), представляющим собой трехмерную клапанную конструкцию, а также использование сигналов, регулирующих экспрессию генов, организацию и продуктивность пересаженных клеток в течение периода формирования экстрацеллюлярного матрикса.

Такие искусственные клапаны сердца интегрируются с тканью больного для окончательного восстановления и дальнейшего поддержания своей структуры и функции. При этом на исходной матрице в результате функционирования клеток (фибробластов, миофибробластов и др.) формируется новый коллагеноэластиновый каркас или, точнее, экстрацеллюлярный матрикс. В итоге, оптимальные искусственные клапаны сердца, созданные методом тканевой инженерии, должны по анатомической структуре и своей функции приближаться к нативному, а также обладать биомеханической адаптируемостью, способностью к репарации и росту.

Тканевая инженерия разрабатывает искусственные клапаны сердца с использованием различных источники забора клеток. Так, могут применяться ксеногенные или аллогенные клетки, хотя первые связаны с риском переноса зоонозов человеку. Снизить антигенность и предотвратить реакции отторжения организма возможно генетической модификацией аллогенных клеток. Для тканевой инженерии необходим надежный источник получения клеток. Таким источником являются аутогенные клетки, забираемые непосредственно от пациента и не дающие иммунных реакций во время реимплантации. Эффективные искусственные клапаны сердца произведены на основе аутологичных клеток, полученных из кровеносных сосудов (артерий и вен). Для получения чистых клеточных культур разработан метод, основанный на использовании флюоресцентактивированной сортировки клеток – FACS. Смешанная клеточная популяция, полученная из кровеносного сосуда, метится ацетилированным, обладающим пониженной плотностью, липопротеиновым маркером, который избирательно абсорбируется на поверхности эндотелиоцитов. Эндотелиоциты впоследствии можно легко отделить от основной массы клеток, полученных из сосудов, которая будет представлена смесью из гладкомышечных клеток, миофибробластов и фибробластов. Источник клеток, будь то артерия или вена, будет влиять на свойства конечной конструкции. Так, искусственные клапаны сердца с матрицей, засеянной венозными клетками, по степени сформированности коллагена и механической стабильности превосходят конструкции, засеянные артериальными клетками. Выбор периферических вен представляется более удобным источником забора клеток.

Миофибробласты также могут забираться из сонных артерий. Вместе с тем, клетки, полученные из сосудов, существенно отличаются своими характеристиками от естественных клеток интерстиция. В качестве альтернативного источника клеток могут быть использованы аутогенные клетки пуповины.

Искусственные клапаны сердца на основе стволовых клеток

Прогрессу тканевой инженерии в последние годы способствуют исследования стволовых клеток. Использование стволовых клеток красного костного мозга имеет свои преимущества. В частности, простота забора биоматериала и культивирования in vitro с последующей дифференциацией в различные типы мезенхимальных клеток позволяет избежать использования интактных сосудов. Стволовые клетки являются плюрипотентными источниками клеточных ростков, имеют уникальные иммунологические характеристики, способствующие их стабильности в аллогенных условиях.

Человеческие стволовые клетки красного костного мозга получают посредством стернальной пункции или пункции гребня подвздошной кости. Их выделяют из 10-15 мл аспирата грудины, отделяют от других клеток и культивируют. По достижении необходимого числа клеток (обычно в течение 21-28 сут) производят их засевание (колонизацию) на матрицы, культивируют в питательной среде в статическом положении (в течение 7 сут в увлажненном инкубаторе при 37 °С в присутствии 5% СО2). В дальнейшем стимуляция клеточного роста осуществляется через купьтуральную среду (биологические стимулы) или через создание физиологических условий роста ткани при ее изометрической деформации в аппарате репродукции с пульсирующим потоком – биореакторе (механические стимулы). Фибробласты чувствительны к механическим стимулам, которые способствуют их росту и функциональной активности. Пульсирующий поток вызывает увеличение как радиальных, так и окружных деформаций, что приводит к ориентации (вытянутости) заселенных клеток в направлении действия таких напряжений. Это приводит, в свою очередь, к формированию ориентированных волоконных структур створок. Постоянный поток вызывает только касательные напряжения на стенках. Пульсирующий поток благотворно сказывается на клеточной морфологии, пролиферации и составе экстрацеллюлярного матрикса. Характер потока питательной среды, физико-химические условия (рН, рО2 и рСО2) в биореакторе также существенно влияют на продукцию коллагена. Так, ламинарный поток, циклические вихревые токи увеличивают продукцию коллагена, что приводит к улучшению механических свойств.

Другой подход в выращивании тканевых структур состоит в создании эмбриональных условий в биореакторе вместо моделирования физиологических условий человеческого организма. Выращенные на основе стволовых клеток тканевые биоклапаны имеют подвижные и пластичные створки, функционально состоятельные при воздействии высокого давления и потока, превышающего физиологический уровень. Гистологическое и гистохимическое исследования створок этих структур показали наличие в них активно протекающих процессов биодеструкции матрицы и замещения ее жизнеспособной тканью. Ткань организована по слоистому типу с характеристиками протеинов экстрацеллюлярного матрикса, подобными характеристикам нативной ткани наличием коллагена I и III типа и гликозаминогликанов. Однако не было получено типичного трехслойного строения створок – вентрикулярного, спонгиозного и фиброзного слоев. Обнаруженные во всех фрагментах ASMA-позитивные клетки, экспрессирующие виментин имели характеристики, схожие с характеристиками миофибробластов. При электронной микроскопии были обнаружены клеточные элементы с признаками, характерными для жизнеспособных, секреторно активных миофибробластов (актин/миозиновые филаменты, коллагеновые нити, эластин), а на поверхности ткани – эндотелиальные клетки.

На створках были обнаружены коллаген I, III типов, ASMA и виментин. Механические свойства створок тканевых и нативных структур были сопоставимы. Тканевые искусственные клапаны сердца показывали превосходную производительность в течение 20 нед и напоминали естественные анатомические структуры по своей микроструктуре, биохимическому профилю и формированию протеинового матрикса.

Все искусственные клапаны сердца, полученные методом тканевой инженерии, имплантировались животным в легочную позицию, поскольку их механические характеристики не соответствуют нагрузкам в аортальной позиции. Эксплантированные от животных тканевые клапаны по своей структуре близки к нативным, что свидетельствует о дальнейшем их развитии и перестройке в условиях in vivo. Будет ли процесс перестройки и созревания ткани продолжаться в физиологических условиях после того, как искусственные клапаны сердца имплантируются, как это наблюдалось в экспериментах на животных, покажут дальнейшие исследования.

Идеальные искусственные клапаны сердца должны обладать пористостью не менее 90%, поскольку это существенно для клеточного роста, доставки питательных веществ и удаления продуктов метаболизма клеток, Помимо биологической совместимости и способности к биодеструкции, искусственные клапаны сердца должны иметь химически благоприятную для засевания клеток поверхность и соответствовать механическим свойствам естественной ткани. Уровень биодеструкции матрицы должен быть управляемым и пропорциональным уровню образования новой ткани для обеспечения гарантии механической стабильности в течение определенного времени.

В настоящее время ведутся разработки синтетических и биологических матриц. Наиболее распространенными биологическими материалами для создания матриц являются донорскиеанатомические структуры, коллаген и фибрин. Полимерные искусственные клапаны сердца разрабатываются таким образом, чтобы биодеградировать после имплантации, как только имплантированные клетки начнут производить и организовывать свою собственную внеклеточную матричную сеть. Формирование новой матричной ткани можно регулировать или стимулировать с помощью факторов роста, цитокинов или гормонов.

[7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]

Донорские искусственные клапаны сердца

Донорские искусственные клапаны сердца, полученные от человека или животных и лишенные клеточных антигенов путем децеллюляризации для снижения их иммуногенности, можно использовать в качестве матриц. Сохранившиеся протеины экстрацеллюлярного матрикса являются основой для последующей адгезии засеваемых клеток. Существуют следующие способы удаления клеточных элементов (ацеллюляризации): замораживание, обработка трипсин/EDTA, детергентами – додецил сульфатом натрия, деоксиколатом натрия, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, а также многостадийные способы ферментативной обработки. При этом удаляются мембраны клеток, нуклеиновые кислоты липиды, цитоплазматические структуры и растворимые молекулы матрикса с сохранением коллагена и эластина. Однако идеального способа пока не найдено. Только додецил сульфат натрия (0,03-1%) или деоксиколат натрия (0,5-2%) приводили к полному удалению клеток после 24 ч обработки.

Гистологическое исследование удаленных децеллюляризованных биоклапанов (аллографта и ксенографта) в эксперименте на животных (собаке и свинье) показало, что происходят частичные эндотелизация и врастание миофибробластов реципиента в основание, отсутствуют признаки его кальциноза. Отмечена умеренно выраженная воспалительная инфильтрация. Однако при клинических испытаниях децеллюляризованного клапана SynerGraftTM развивалась ранняя недостаточность. В матриксе биопротеза определялась выраженная воспалительная реакция, которая вначале была неспецифической и сопровождалась лимфоцитарной реакцией. Дисфункция и дегенерация биопротеза развивались в течение одного года. Заселения матрикса клетками не было отмечено, однако были выявлены кальциноз створок и предимплантационные остатки клеток.

Засеянные эндотелиальными клетками бесклеточные матрицы и культивированные в условиях in vitro и in vivo образовывали целостный слой на поверхности створок, а засеянные интерстициальные клетки нативной структуры показали свою способность к дифференциации. Однако достичь необходимого физиологического уровня колонизации клеток на матриксе в динамических условиях биореактора не удавалось, а имплантированные искусственные клапаны сердца сопровождались достаточно быстрым (три месяца) утолщением за счет ускоренной клеточной пролиферации и образования экстрацеллюлярного матрикса. Таким образом, на данном этапе использование донорских бесклеточных матриц для их колонизации клетками имеет ряд нерешенных проблем, 8 том числе иммунологического и инфекционного характера работа над децеллюляризованными биопротезами продолжается.

Следует отметить, что коллаген также является одним из потенциальных биологических материалов для изготовления матриц, способных к биодеградации. Он может использоваться в виде пены, геля или пластин, губок и в качестве заготовки на волоконной основе. Однако применение коллагена связано с рядом технологических трудностей. В частности, его трудно получить от больного. Поэтому в настоящее время большинство коллагеновых матриц имеет животное происхождение. Замедленная биодеградация животного коллагена может нести повышенный риск заражения зоонозами, вызывать иммунологические и воспалительные реакции.

Фибрин – еще один биологический материал, имеющий управляемые характеристики биодеградации. Поскольку фибриновые гели могут быть изготовлены из крови пациента для последующего изготовления аутологичной матрицы, то имплантация такой структуры не вызовет его токсической деградации и воспалительной реакции. Однако фибрину присущи такие недостатки, как диффузия и вымывание в окружающую среду и низкие механические характеристики.

[14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]

Искусственные клапаны сердца из синтетических материалов

Искусственные клапаны сердца изготавливают также из синтетических материалов. Несколько попыток изготовления матриц клапанов были основаны на использовании полиглактина, полигликолевой кислоты (PGA), полилактической кислоты (PLA), сополимера PGA и PLA (PLGA) и полигидроксиалканоатов (РНА). Высокопористый синтетический материал может быть получен из плетеного или неплетеного волокна и с использованием технологии солевого выщелачивания. Перспективный композитный материал (PGA/ Р4НВ) для изготовления матриц получен из неплетеных петель полигликолевой кислоты (PGA), покрытых поли-4-гидроксибутиратом (Р4НВ). Изготовленные искусственные клапаны сердца из этого материала стерилизуются оксидом этилена. Однако значительная начальная жесткость и толщина петель этих полимеров, их быстрая и бесконтрольная деградация, сопровождающаяся выделением кислых цитотоксичных продуктов, требуют дальнейших исследований и поиска других материалов.

Использование пластин тканевых культур аутологичных миофибробластов, культивированных на каркасе, с целью формирования опорных матриц за счет стимулирования продукции этих клеток позволило получить образцы клапанов с активными жизнеспособными клетками, окруженными внеклеточным матриксом. Однако механические свойства тканей этих клапанов пока недостаточны для их имплантации.

Необходимый уровень пролиферации и регенерации ткани создаваемого клапана может быть не достигнут путем только объединения клеток и матрицы. Экспрессия клеточного гена и формирование ткани может регулироваться или стимулироваться добавлением факторов роста, цитокинов или гормонов, митогенных факторов или факторов адгезии в матрицах и матриксах. Изучается возможность внедрения этих регуляторов в биоматериалы матрицы. В целом, имеется существенный недостаток исследований по регуляции процесса формирования тканевого клапана биохимическими стимулами.

Бесклеточный свиной ксеногенный легочный биопротез Matrix P состоит из децеллюляризованной ткани, обработанной посредством специальной запатентованной процедуры AutoTissue GmbH, включающей обработку антибиотиками, деоксихолатом натрия и спиртом Данный способ обработки, утвержденный Международной организацией по стандартизации, устраняет все живые клетки и постклеточные структуры (фибробласты, эндотелиоциты, бактерии, вирусы, грибки, микоплазмы), сохраняет архитектонику экстрацеллюлярного матрикса, снижает уровень ДНК и РНК в тканях до минимума, что сводит к нулю вероятность трансмиссии свиного эндогенного ретровируса (PERV) человеку. Биопротез Matrix P состоит исключительно из коллагена и эластина с сохраненной структурной интеграцией.

В ходе экспериментов на овцах была зарегистрирована минимальная реакция со стороны окружающих тканей через 11 месяцев после имплантации биопротеза Matrix Р с хорошими показателями его приживаемости, что, в частности, проявлялось в блестящей внутренней поверхности его эндокарда. Фактически отсутствовали воспалительные реакции, утолщение и укорочение створок клапана. Также был зарегистрирован низкий уровень кальция ткани биопротеза Matrix P, разница была статистически значима в сравнении с обработанными глутаровым альдегидом.

Искусственные клапаны сердца Matrix P адаптируется к индивидуальным условиям пациента в течение нескольких месяцев после его имплантации. При исследовании по истечении контрольного срока выявлены интактный внеклеточный матрикс и сливной эндотелий. Ксенографт Matrix R имплантированный при операции Росса, выполненной у 50 пациентов с врожденными пороками в период с 2002 по 2004 г, показал превосходную производительность и более низкие трансклапанные градиенты давления по сравнению с криоконсервированными и децеллюляризованными аллографтами SynerGraftMT, а также бескаркасными биопротезами, обработанными глутаровым альдегидом. Искусственные клапаны сердца Matrix P предназначен для протезирования клапана легочной артерии при реконструкции выходного тракта правого желудочка в хирургии врожденных и приобретенных пороков и при протезировании легочного клапана в ходе процедуры Росса, доступен в 4 типоразмерах (по внутреннему диаметру): для новорожденных (15-17 мм), для детей (18-21 мм), промежуточный (22-24 мм) и взрослый (25-28 мм).

Прогресс в разработке клапанов на основе тканевой инженерии будет зависеть от успехов клапанной клеточной биологии (включая вопросы экспрессии гена и регуляцию), изучения эмбриогенного и возрастного развития клапанов (включая ангиогенные и неврогенные факторы), точного знания биомеханики каждого клапана, идентификации адекватных клеток для заселения, разработки оптимальных матриц. Для дальнейшей разработки более совершенных тканевых клапанов необходимо полное понимание взаимоотношения между механическими и структурными характеристиками нативных клапанов и стимулов (биологических и механических) для воссоздания этих характеристик in vitro.

[21], [22], [23], [24], [25]