Сосуд для семени быков

 ТОДОР АРБОВ, генеральный менеджер по странам Восточной Европы

ABSGlobal- мировой лидер по производству семени быков с высоким генетическим потенциалом. Ежегодный объем продаж — 12 млн. спермодоз в более чем 100 стран мира. На российский рынок компания ABSGlobal поставляет семя от проверенных по потомству быков из США и Канады. Наше представительство в России, зарегистрированное в Белгороде, — компания 000 «Генетика ПИК».

Качество замороженного семени, поставляемого на фермы, определяется племенной ценностью быка-производителя и биологическими показателями спермопродукции. Поставляемое нашей компанией семя производится с соблюдением высоких стандартов технологии и постоянно проходит строгую проверку на соответствие качеству. Однако даже самое высококачественное семя, обладающее высокой оплодотворяющей способностью, может прийти в негодность при ненадлежащем обращении или хранении.

Приводим рекомендации по эксплуатации сосудов Дьюара для хранения спермопродукции и по работе с ней.

Замороженное бычье семя может храниться неограниченно долго в жидком азоте при температуре -196оС. Критическая температура -135оС. Если она окажется выше даже на короткий промежуток времени, а затем семя снова поместят в контейнер, это может привести к необратимым повреждениям сперматозоидов. Степень повреждения зависит от длительности пребывания пайет в условиях повышенной температуры.

Эксплуатация сосудов для хранения семени

Сосуд Дьюара для хранения семени представляет собой большой металлический двустенный контейнер с вакуумной камерой для эффективной теплоизоляции, позволяющей поддерживать температуру — 180оС (температура азотных паров) даже при уровне жидкого азота 1 см. Однако такого количества азота хватит на очень короткий промежуток времени. Поэтому во избежание риска гибели семени рекомендуем своевременно пополнять жидким азотом контейнер до 1/4 от его объема. В современных сосудах с жидким азотом семя может храниться 4-9 месяцев. Инновационные технологии позволяют создать емкости с внутренними стенками из губчатого материала, способного абсорбировать жидкий азот и поддерживать температуру — 180оС за счет азотных паров. Такие сосуды более пригодны для транспортировки, поскольку не являются опасным грузом и при падении исключена утечка азота. Тем самым сохраняется необходимый температурный режим. После транспортировки сосуды можно заполнить жидким азотом и использовать для долгосрочного хранения спермопродукции.

Выемка семени из сосуда

Вынимать семя из одного сосуда и перемещать в другой следует за 10 секунд, а при высокой температуре окружающей среды или при сильном движении воздуха — за 5 секунд. В течение короткого промежутка времени сохраняется безопасный температурный режим. У соломинок объемом 0,25 мл гораздо меньший диаметр, поэтому они более чувствительны к изменениям температуры.

Процедура оттаивания

Оттаивать семя следует в теплой воде с температурой 35-37оС не менее 30 секунд. Затем соломинки следует вытереть насухо чистой салфеткой.

Удаление воздушных пузырей

Перед тем как отрезать кончик соломинки, ее надо аккуратно потрясти, чтобы воздушные пузыри переместились к запаянному концу. Это не нанесет семени никакого вреда! Если этого не сделать, будет утрачено 5% семени.

Защита от воздействия внешней среды

Во время подготовки инструмента для осеменения сперму следует предохранять от воздействия внешней среды. Несоблюдение данного требования грозит тем, что семя испытает температурный шок как от внезапного охлаждения, так и от повышения температуры. То и другое снизит его оплодотворяющую способность.

Количество спермодоз

Оттаивать надо строго определенное количество спермодоз, которыми технолог по воспроизводству может осеменить коров в течение 10 минут. Однако фактическое количество спермодоз для оттаивания следует рассчитывать с учетом расстояния от контейнера до коров, подлежащих осеменению, и квалификации технолога по воспроизводству.

В течение последних лет фасовка в пайеты 0,25 мл стала все более популярна благодаря более высокой выживаемости спермиев, простоте хранения и размораживания. В большинстве прогрессивных стран мира, включая США и Канаду хозяйства стали успешно переходить на пайеты 0,25 мл.

Начиная с апреля 2008 года компания «Альта Дженетикс» практически полностью перешла на фасовку всей произведенной спермопродукции в «улучшенные» пайеты объём 0,25 мл. Глобальная тенденция перехода на пайету 0,25 наблюдается по всему миру.

Также стоит отметить, что в настоящий момент все произведенное в мире сексированное семя фасуется именно в пайеты 0,25. С учетом более низкой концентрации спермиев, сексированное семя является очень чувствительным продуктом и фасовка в пайеты 0,25 гарантирует его максимальную эффективность.

В пайетах 0,25 мл — сперма лучше переносит процесс заморозки

Повреждению спермиев способствует ряд факторов, включая температуру и осмотическое давление при замораживании и оттаивании. Эти повреждения отражаются на морфологии и функциональных характеристиках спермиев. Общеизвестно, что наибольшим повреждениям спермии подвергаются во время процедур замораживания и оттаивания. Данные этапы имеют огромное влияние на оплодотворяющую способность семени.

Эксперименты по сравнению выживаемости спермиев КРС после размораживания при фасовке в пайеты по 0,25 мл и 0,5 мл показали, что сперма лучше переносит замораживание в соломинках объемом 0,25 мл, что объясняется размерами минипайеты с меньшим диаметром 2,0 мм по сравнению с более крупной соломинкой диаметром 2,8 мм.

Рисунок 1: У спермы, разбавленной в концентрации 6·106 на соломинку, при фасовке в пайеты по 0,25 мл жизнеспособность после оттаивания и в стрессовых условиях лучше на 5,7 и 3,5%, соответственно.

Разный диаметр влияет на теплопередачу в обоих направлениях: как из пайеты вовне во время замораживания, так и внутрь пайеты во время оттаивания. Во-первых, у спермы в центре и у стенок минипайеты более равномерная скорость замораживания и оттаивания, чем в большей соломинке, вследствие большего соотношения площади поверхности к объему. Во-вторых, у спермиев в пайете 0,25 мл. выше скорость замораживания и оттаивания. Поэтому замораживание в малых объемах обеспечивает оптимальную скорость замораживания для большего количества спермы, чем при замораживании в больших объемах, когда скорость замораживания спермы на поверхности дозы будет выше, чем спермы, расположенной в центре дозы. Именно эти факторы способствуют лучшей выживаемости замороженных спермиев в пайете 0,25 мл.

Рисунок 2: У спермы, разбавленной в концентрации 20·106 на соломинку, при фасовке в пайеты по 0,25 мл жизнеспособность после оттаивания и в стрессовых условиях лучше на 3,3 и 4,0% соответственно.  

Пайеты 0,25 мл – Больше фертильности

Существует ряд сравнительных исследований, свидетельствующих о преимуществах использования пайет 0,25 мл. Для того чтобы лучше проанализировать, как фасовка семени влияет на ее оплодотворяющую способность, мы свели вместе данные исследований, опубликованных за последние сорок лет. История исследований показывает, что пайеты 0,25 мл показывали результаты лучше, чем пайеты 0,5 мл во всех испытаниях.

Таблица: Независимые исследования по сравнению оплодотворяющей способности спермы, расфасованной в пайеты различного объема, с использованием разделенной пробы одной спермы и одинакового количества спермиев на дозу осеменения.

Объединенные результаты независимых исследований демонстрируют, что при осеменении с помощью 0,25-миллилитровых соломинок получено на 1,4% больше стельностей, чем при использовании традиционных 0,5-миллилитровых соломинок.

Резюме

• «Улучшенная» пайета объемом 0,25 мл была разработана, чтобы минимизировать повреждение спермиев при замораживании и оттаивании спермы
• В пайете объемом 0,25 мл содержится такое же количество спермиев, что и в пайете 0,5 мл.
• Многолетние исследования показывают, что в пайете объемом 0,25 мл после оттаивания сохраняется на 3-6% больше жизнеспособных спермиев, что в результате улучшает оплодотворяющую способность.
• Исследования так же показали что оплодотворяющая способность семени в пайетах 0,25 мл минимум на 1-2% выше, чем в традиционной пайете 0,5 мл..
• Использование пайет объемом 0,25 более удобно, требует меньше места того, при использовании 0,25-миллилитровых соломинок фермеру требуется вполовину меньше места для хранения.

Производство и использование разделенного по полу семени меняет сферу разведения КРС. Есть замечательная статья на эту тему Advances in sexed semen production, написанная Леонардо Ф. С. Брито, директором подразделения ST Genetics по глобальному контролю качества. Пересказываем для читателей нашего блога самое главное из экспертного материала.

Введение

За последние 10 лет в индустрии животноводства произошла революция. В ее основе селекция на основе геномной оценки, а также коммерческое использование разделенного по полу семени для искусственного осеменения. Хотя применение сексированного семени считается репродуктивной биотехнологией, ее также можно отнести к генетической селекции, ведь пол — это генетическая характеристика, причем наиболее важная, так как влияет на всю систему воспроизводства.

Большей частью генетических характеристик можно управлять методами селекции. Но пока сперму не научились разделять по полу, производители ничего не могли сделать с тем фактом, что вероятность рождения телят мужского пола составляет 51%. Соответственно, сексированное семя стало в свое время и остается сейчас ключевым фактором эффективности в отрасли.

С начала коммерческого использования сексированной спермы ее производство значительно улучшилось. Сейчас технология продолжает развиваться бурными темпами. Результатом ее совершенствования стало появление нового продукта — SexedULTRA 4M. Под этой торговой маркой реализуется ультрасексированная сперма с концентрацией сперматозоидов 4 000 000. Ее использование позволяет поддерживать тот же уровень плодотворных осеменений, что с традиционной спермопродукцией.

Вся сексированная спермопродукция в каталоге «БулСелектСервис» — это семя SexedULTRA 4M.

Краткая история разделения семени по полу

Разделять сперму по полу начали в правительственных исследовательских центрах в США. Пионерами были ученые Ливермольской Национальной Исследовательской лаборатории имени Э. Лоуренса, которые в 1970-х изучали, как действует радиация на сперму мышей. Чтобы выявлять повреждения зародышевой линии в лаборатории Лоуренса разработали проточные цитометрические технологии. Эти технологии окрыли возможность для точного анализа ДНК спермы и в дальнейшем — для выявления Х и Y-сперматозоидов на основе различий в ДНК.

Следующий важный шаг был сделан в Сельскохозяйственном исследовательском Центре (Белтсвилл, США) в восьмидесятые и девяностые. Прорыв состоял в изменениях методов окрашивания спермиев и развитии технологии проточной цитометрии. В результате искусственного осеменения сексированной спермой родились живые кролики. Это продемонстрировало коммерческий потенциал технологии.

В середине 1990-х компания XY получает лицензию от Министерства сельского хозяйства США и финансирование от государства и частных инвесторов на коммерческое развитие технологии разделения по полу спермы млекопитающих. Совершенствование высокоскоростной проточной цитометрии привело к скачку в производстве разделенного по полу семени. Полностью двери для коммерческого использования метода открылись с разработкой технологии криоконсервации сексированного семени, которая уже в 1999 году продемонстрировала приемлемые показатели стельности от осеменения размороженной сексированной спермой.

В начале 2000 года племенные центры получили коммерческие лицензии, стартовало тестирование технологии по всему миру. Ключевым моментом стала выдача лицензии на разделение спермы по полу компании Sexing Technologies (ST) в 2004 году. В 2007-м Sexing Technologies приобрела компанию XY и сформировала новый подход к коммерческой сортировке семени, чтобы предоставить племенным центрам более широкий доступ к сексированной сперме. Сейчас технологии ST по производству сексированного семени от разнообразных групп лучших быков используют крупнейшие мировые центры по искусственному осеменению.

Экскурс в производство сексированного семени

Технология основана на разнице в ДНК между мужской и женской хромосомами, вследствие которой яйцеклетки и сперматозоиды имеют разный размер. В среднем, различие составляет около 4% с вариациями у разных пород (4,22% у джерсеев, 4,07% у ангусов, 4,01% у голштинов). Для окрашивания используется вещество Hoechst 33342 (Н33342). Оно проникает в мембрану клетки и избирательно связывается с A/T базовыми парами. Hoechst 33342 демонстрирует относительно высокую точность в определении количества ДНК в живых клетках посредством метода проточной цитометрии. Для количественного анализа состава ДНК спермы используют проточный цитометр.

Сперматозоиды с Х хромосомой содержат на 4% больше ДНК, чем сперматозоиды с Y хромосомой. За счет этого они поглощают больше красителя — на 4%. Количество поглощенного красителя влияет на уровень флуоресцентного излучения. Специальное ПО анализирует относительную флуоресценцию популяций X и Y-сперматозоидов. Происходит отбор гамет требуемого пола.

За счет высокой производительности сортировки за единицу времени производится максимальное количество пайет. За секунду через сортировочное оборудование проходит больше 40 000 спермиев. 9 300 сперматозоидов за секунду определяются пригодными. Различные модели сортировки позволяют планировать производство семени с учетом возраста быков и спроса.

Пробирки, в которые собирают отсортированную сперму, содержат специальные буферы. Они защищают спермии в процессе сортировки и охлаждения. Пробирки медленно охлаждают до 5°C, добавляют криопротекторы, пропускают через центрифугу, чтобы получить концентрированные гранулы спермы. Сперме дается время на стабилизацию, затем она расфасовывается в пайеты, которые криоконсервируются с соблюдением оптимальной кривой замораживания.

Перед использованием, т.е. после оттаивания, необходим контроль качества. Он включает оценку подвижности сперматозоидов, целостности акросомы и концентрации, а также бактериологический анализ. В целом процесс производства сексированного семени состоит из 20 с лишним этапов.

Секреты производства семени SexedULTRA TM

Официально продукт под брендом SexedULTRA TM был запущен в 2013 году. Этому предшествовала серия инновационных разработок. Результатом стало решение, которое сильно отличалось от классической технологии компании ХY. Среди новшеств: оптимизация жидкостной среды для проточной цитометрии, совершенствование разбавителей и сред, оптимизация процесса окрашивания. При этом модернизированное оборудование поставлялось по всему миру.

Классическое оборудование для сортировки спермы адаптировали на основе медицинских исследований. Оптимизация оборудования привела к сокращению флюидной нестабильности и давления, снижению шума и акустических вибраций с одновременным улучшением отбора спермиев. Сейчас на объектах ST используется твердотельный лазер, двойные ортогональные детекторы, передовое цифровые устройства для сортировки субпопуляций X- или Y-сперматозоидов.

В группе компаний ST появилась новая структура Cytonome, которая специализируется на технологиях проточной цитометрии. Крупное достижение Cytonome — разработка нового сортировочного оборудования Genesis TM. С появлением этого технического чуда разделение спермы по полу вступило в новую, крупномасштабную, промышленную эру.

Еще на этапе первичных лабораторных испытаний стало ясно, что качество семени, полученного по новой технологии SexedULTRA TM, выше, чем у традиционной сексированной спермы. Более того, использование семени SexedULTRA TM увеличило показатели формирования бластоцист, подходящих для заморозки. Также было выявлено, что у телок Голштинской и Джерсейской пород при осеменении ультрасексированной спермой показатель стельности вырастает на 7,4%.

С 2013 года, с момента выхода на рынок SexedULTRA TM, выросла как доля использования сексированной спермы, так и результаты плодотворных осеменений. Становится все более распространенным использование сексированной спермы на коровах Голштинской породы первой и второй лактации. На телках и коровах Джерсийской породы традиционное семя практически не применяется. Процент плодотворных осеменений при использовании SexedULTRA TM достигает 85-90%.

Благодаря усовершенствованию технологии показатель плодотворных осеменений сексированным семенем на тёлках вырос с 42% в 2007 году до 49% в 2015 году. Для сравнения приведем аналогичные показатели для оплодотворения обычным семенем: 56% в 2007 году и 59% 2015 году. Показатели плодотворных осеменений сексированным семенем на коровах выросли с 26% в 2007 году до 30% в 2015 году. Показатели оплодотворения традиционным семенем в этот же период: 30% и 32%.

SexedULTRA 4M TM — новый стандарт сексированного семени

Технология продолжала развиваться. В ряде исследований эякуляты 5 быков были разделены на четыре порции: сексированную сперму с концентрацией 2,1 миллион, полученную по технологии XY, а также сперму с концентрацией 2,1 миллиона, 3 миллиона и 4 миллиона, полученную по технологии SexedULTRA TM. В качестве контрольного образца использовали традиционную сперму с концентрацией 15 миллионов.

7 855 телок осеменили сексированным семенем, 626 398 — традиционным. Сексированная сперма XY с концентрацией 2,1 показала более низкие показатели плодотворных осеменений, чем традиционная и SexedULTRA TM разной концентрации. SexedULTRA TM 2,1 миллиона и 3 миллиона дала более низкие результаты по сравнению с традиционной спермой. А вот повышение концентрации до 4 миллионов сперматозоидов в дозе позволило добиться результатов, сопоставимых с показателями традиционной спермы. Так появился новый продукт SexedULTRA 4M TM, который с 2015 года принят компанией ST Genetics в качестве нового стандарта разделенной по полу спермы.

Официально сперма SexedULTRA 4M TM вышла на рынок 2017 году. Компания установила, что вывод нового продукта SexedULTRA 4M на рынок спермопродукции обеспечило дополнительное увеличение уровня плодотворных осеменений, особенно на телках Голштинский породы. Другие компании вскоре после этого тоже заявили о выпуске подобных продуктов. Несомненно, ультрасексированная сперма в ближайшей будущем станет новым мировым стандартом разделения семени по полу.