Выращивание сосудов из стволовых клеток

Yonatan Israeli et al. / bioRxiv, 2020

Ученым впервые удалось вырастить в культуре человеческое мини-сердце. В органоиде сформировались все основные типы сердечных клеток, а также структуры, похожие на коронарные сосуды и камеры сердца. Маленькие сердца регулярно сокращались, а по строению, развитию и экспрессии генов органоиды были похожи на настоящие сердца человеческого эмбриона. Протокол создания таких сердец прост и воспроизводим, пишут ученые в препринте на портале bioRxiv.

Сердечно-сосудистые заболевания – основная причина смертности в мире, а с врожденным пороком сердца рождается около одного процента детей. Исследование этих болезней затруднено из-за ограниченного выбора модельных объектов: работы проводят в основном на органах животных или клеточных культурах, которые по физиологическим, анатомическим и биохимическим особенностям отличаются от сердца человека.

Удобным решением было бы выращивание целых искусственных сердец in vitro из стволовых клеток – так создают, например, органоиды почек или кишечника. В последние десятилетия биологи научились выращивать из стволовых клеток разнообразные клеточные линии и целые ткани сердца, однако пока никому не удавалось смоделировать в культуре развитие целых органоидов, которые анатомически и гистологически были бы близки к человеческому сердцу.

Ученые из США под руководством Айтора Агирре (Aitor Aguirre) из Университета штата Мичиган разработали протокол выращивания сердечных органоидов. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки центрифугировали так, что те слипались в шарообразные структуры, а затем выращивали поочередно в средах с разными концентрациями активатора и ингибитора сигнального пути Wnt.

К 15 дню выращивания сформировался двухслойный органоид сферической формы: снаружи клетки эпикарда, внутри – кардиомиоциты. Уже на шестой день клеточный шар начал сокращаться, а к десятому биение стало регулярным. Органоид был пронизан сетью эндотелиальных клеток с просветом, похожую на систему коронарных сосудов. Кроме того, в искусственном сердце сформировалось несколько пустот, выстланных эндотелием и напоминающих камеры сердца. Формирование сосудов и камер удалось усилить, когда в среду добавили два морфогена: BMP4 и активин A.

Клетки моикарда (красный) и эпикарда (зеленый и серый) в органоиде, выращенном в разных концентрациях ингибитора Wnt

Yonatan Israeli et al. / bioRxiv, 2020

Пустоты органоида, похожие на камеры сердца

Yonatan Israeli et al. / bioRxiv, 2020

Секвенирование РНК органоида на разных сроках подтвердило, что стадии его развития такие же, как у сердца человеческого эмбриона. В органоиде экспрессировались гены, обеспечивающие главные функции сердца: проводимость, сократимость, кальциевый обмен. Ученые также обнаружили в органоиде все главные типы клеток сердца, в том числе клетки эпикарда, эндотелия, эндокарда и фибробласты. Такого гистологического разнообразия и генетического сходства с настоящим сердцем не удавалось достичь в однослойных клеточных культурах.

В заключение авторы работы подчеркнули, что придуманный ими протокол прост (достаточно обычного для выращивания клеточных линий оборудования) и воспроизводим. Полученный сердечный органоид по разнообразию клеток и морфологической организации похож на сердце человеческого эмбриона, а значит, на нем можно изучать как нормальное развитие сердца, так и его отклонения.

Органоиды некоторых других органов ученые научились успешно выращивать уже давно. Мы писали, например, о мини-кишечнике с нервной системой и мини-плаценте, а выращиванию мозга «в пробирке» и возникающим этическим проблемам посвящен наш материал «Из головы вон».

Алиса Бахарева

Источник

Возможность вырастить человеческий орган в пробирке и пересадить его человеку, нуждающемуся в пересадке – мечта трансплантологов. Ученые по всему миру работают над этим и уже научились делать ткани, небольшие работающие копии органов, и до полноценных запасных глаз, легких и почек нам на самом деле осталось совсем немного.

Возможность вырастить человеческий орган в пробирке и пересадить его человеку, нуждающемуся в пересадке – мечта трансплантологов. Ученые по всему миру работают над этим и уже научились делать ткани, небольшие работающие копии органов, и до полноценных запасных глаз, легких и почек нам на самом деле осталось совсем немного. Пока что органеллы используются в основном в научных целях, их выращивают, чтобы понять, как работают органы, как развиваются болезни. Но от этого до трансплантации всего несколько шагов. МедНовости собрали сведения о самых перспективных проектах.

Легкие. Ученые из Техасского университета вырастили легкие человека в биореакторе. Правда, без кровеносных сосудов такие легкие не функциональны. Однако команда ученых из Медицинского центра Колумбийского университета (Columbia University Medical Center, New York) недавно впервые в мире получили функциональное легкое с перфузируемой и здоровой сосудистой системой у грызунов ex vivo.

Ткани сердечной мышцы. Биоинженерам из университета Мичигана удалось вырастить в пробирке кусок мышечной ткани. Правда, полноценно сердце из такой ткани пока работать не сможет, она вдвое слабее оригинала. Тем не менее пока это самый сильный образец сердечной ткани.

Кости. Израильская биотехнологическая компания Bonus BioGroup использовалат трехмерные сканы для создания гелеобразного каркаса кости перед посевом стволовыми клетками, взятыми из жира. Кости, получившиеся в результате, они успешно пересадили грызунам. Уже планируются эксперименты по выращиванию человеческих костей по этой же технологии.

Ткани желудка. Ученым под руководством Джеймса Уэллса из Детского медицинского клинического центра в Цинциннати (Огайо) удалось вырастить «в пробирке» трехмерные структуры человеческого желудка при помощи эмбриональных стволовых клеток и из плюрипотентных клеток взрослого человека, перепрограммированных в стволовые. Эти структуры оказались способны вырабатывать все необходимые человеку кислоты и пищеварительные ферменты.

Японские ученые вырастили глаз в чашке Петри. Искусственно выращенный глаз содержал основные слои сетчатки: пигментный эпителий, фоторецепторы, ганглионарные клетки и другие. Трансплантировать его целиком пока возможности нет, а вот пересадка тканей – весьма перспективное направление. В качестве исходного материала были использованы эмбриональные стволовые клетки.

Ученые из корпорации Genentech вырастили простату из одной клетки. Молекулярным биологам из Калифорнии удалось вырастить целый орган из единственной клетки.

Ученым удалось найти единственную мощную стволовую клетку в простатической ткани, которая способна вырасти в целый орган. Таких клеток оказалось чуть меньше 1% от общего числа. В исследовании 97 мышам трансплантировали такую клетку под почку и у 14 из них выросла полноценная простата, способная нормально функционировать. Точно такую же популяцию клеток биологи нашли и в простате человека, правда, в концентрации всего 0,2%.

Сердечные клапаны. Швейцарские ученые доктор Саймон Хоерстрап (Simon Hoerstrup) и Дорта Шмидт (Dorthe Schmidt) из университета Цюриха (University of Zurich) смогли вырастить человеческие сердечные клапаны, воспользовавшись стволовыми клетками, взятыми из околоплодной жидкости. Теперь медики смогут выращивать клапаны сердца специально для неродившегося еще ребенка, если у него еще в зародышевом состоянии обнаружатся дефекты сердца.

Ушная раковина. Используя стволовые клетки, ученые вырастили ухо человека на спине крысы. Эксперимент был проведен исследователями из Университета Токио (University of Tokyo) И Университета Киото (Kyoto University) под руководством Томаса Сервантеса (Thomas Cervantes).

Кожа. Ученые из Цюрихского университета (Швейцария) и университетской детской больницы этого города впервые сумели вырастить в лаборатории человеческую кожу, пронизанную кровеносными и лимфатическими сосудами. Полученный кожный лоскут способен почти полностью выполнять функцию здоровой кожи при ожогах, хирургических дефектах или кожных болезнях.

Поджелудочная железа. Ученые впервые создали васкуляризованные островки поджелудочной железы, способные вырабатывать инсулин. Еще одна попытка вылечить диабет I типа.

Почки. Ученые из австралийского университета Квинсленда научились выращивать искусственные почки из стволовых клеток кожи. Пока это лишь маленькие органоиды размером 1 см, но по устройству и функционированию они практически идентичны почкам взрослого человека.

Печень. Биологи сразу нескольких стран заявили о том, что смогли вырастить полноценный аналог печени, способный очищать кровь от токсинов и выполнять другие функции этого органа. Для этого ученые использовали стволовые клетки и «заготовки» из стволовых клеток. Эти разработки параллельно велись в Японии, Америке и России.

Источник

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Начало XXI века сопровождается активным развитием тканевой инженерии – дисциплины, объединившей в себе медицину и биотехнологию. Главной задачей этого направления стало создание живых органов для пациентов, нуждающихся в их пересадке. В последнее десятилетие появилось множество работ, свидетельствующих о значительных успехах в этой области. На основе накопленных знаний нами был разработан совершенно новый тканеинженерный сосуд, способный заменить поврежденные артерии. Проведенные эксперименты показали, что с его помощью возможно вырастить кровеносный сосуд непосредственно в живом организме.

Искусственное создание живых тканей, органов и даже целых организмов на протяжении всей истории человечества было предметом мифов, легенд и фантастических историй, и не давало покоя человеческому воображению. Идея создания органов и организмов из одного маленького кусочка живой ткани уходит своими корнями в глубокую древность. В культурной истории человечества как в зеркале отражается развитие взглядов на выращивание органов [1]. Примерами самого раннего возникновения этих идей можно считать древнегреческие мифы о Прометее, а также сотворение Евы из ребра Адама в библейских историях (рис. 1).

Рисунок 1. Сотворение Евы. Фреска Микеланжело Буонарроти (1508-1512).

В процессе того, как расширялись знания людей в понимании природы, возникали все новые научные подходы. Об этом свидетельствует убежденность ученых того времени, что живое существо можно создать с помощью алхимии, отраженная в работах Парацельса. Яркие примеры в искусстве и литературе демонстрируют желание человека самостоятельно создавать жизнь, используя возможности, которые были присущи той или иной эпохе; среди них «Лечение Юстиниана» Фра Анджелико (1439), «Фауст» Иоганна Гете (1774-1831), «Франкенштейн» Мэри Шелли (1818) и многие другие. Параллельно с развитием этих идей в культуре активно шли научно-практические работы по созданию и восстановлению частей человеческого тела. Предпосылками возникновения тканевой инженерии как науки было использование различных материалов для механической замены утерянного органа: различные имплантаты зубов из слоновой кости и металла, деревянные протезы ног и т.д. Но только прорывное открытие Росса Гаррисона (1870-1959), а именно культивирование клеток (то есть, их выращивание в лабораторных условиях) стало основой того, что можно считать классической тканевой инженерией [2].

То, что в одном веке считают мистикой, в другом становится научным знанием.

Парацельс

В настоящее время тканевая инженерия работает над воплощением идей создания органов и их использования в клинической медицине. Тканевая инженерия не только претворяет в жизнь давние мечты и фантазии человечества, но также решает сложные задачи, связанные с заменой поврежденных органов у пациентов [3]. Хорошо известно, что большое число пациентов по всему миру нуждаются в срочной пересадке органов: сердца, легких, печени, почек и т.д., и не всегда дожидаются своей очереди. Кроме того, после пересадки донорского органа остаются проблемы, связанные с отторжением трансплантата. В свою очередь, тканевая инженерия позволяет создавать необходимые органы из клеток самого пациента, предотвращая тем самым негативную реакцию организма на чужеродный орган. Мочевой пузырь, выращенный из собственных клеток пациента, был первым тканеинженерным органом, который трансплантировали человеку. Эта работа была проведена ведущим специалистом в области тканевой инженерии Энтони Аталой (Anthony Atala) и его коллегами в 2006 году [4]. На сегодняшний день с помощью тканевой инженерии ученые создают кожу, кости, хрящи, поджелудочную железу, элементы сердечно-сосудистой системы и т.д. Также большой интерес представляет разработка тканеинженерных кровеносных сосудов, так как они крайне необходимы для проведения операций при заболеваниях, в результате которых у пациента нарушена проходимость сосудов для крови, и при этом невозможно использовать синтетические протезы [5].

Как для создания всех других органов, так и для изготовления тканеинженерного кровеносного сосуда необходимо три основных компонента. Первым и самым важным компонентом являются стволовые клетки, которые представляют собой основной строительный материал для формирования нужного органа. Клетки берут из костного мозга, крови или других тканей пациента и затем культивируют в специальных лабораторных условиях для увеличения их количества. Ткань, из которой получают клеточный материал для культивирования, выбирают в зависимости от того, какие клетки нужны для выращивания данного органа. Для кровеносного сосуда необходимо как минимум два типа клеток: гладкомышечные клетки, которые формируют стенку, и эндотелиальные клетки, которые выстилают внутреннюю поверхность кровеносного сосуда и предохраняют его от образования тромбов. В культуре клетки располагаются одним слоем, но в нашем организме они находятся в трехмерном пространстве, поэтому их необходимо каким-то образом организовать и придать им нужную ориентацию. Для этого в тканевой инженерии существует еще два компонента: матрица и биореактор.

Так называемая тканеинженерная матрица представляет собой каркас будущего органа и имеет пористую структуру. Поры необходимы для того, чтобы в них, как в нишах, располагались клетки. Форма матрицы соответствует форме органа, который необходимо вырастить. В случае с кровеносным сосудом матрица имеет форму трубки с пористыми стенками. Для создания тканеинженерной матрицы необходимо использовать абсолютно безопасный материал, который не вызывает каких-либо аллергических и иммунных реакций. Также для создания некоторых органов, а в особенности кровеносных сосудов, требуются матрицы, обладающие большой прочностью и эластичностью, чтобы выдержать давление, создаваемое током крови. В качестве материала чаще всего используют различные полимеры. К ним относятся природные материалы, такие как коллаген, хитозан, гиалуроновая кислота, а также синтетические полимеры. Матрицы из таких материалов постепенно разрушаются в организме (биодеградируют) и замещаются новыми тканями организма.

Для того чтобы посадить имеющиеся клеточные культуры на матрицу и помочь им образовать новую трехмерную ткань, инженеры сконструировали различные виды биореакторов. Кровеносные сосуды выращивают в пульсирующем биореакторе, который создает поток культуральной жидкости, тем самым имитируя ток крови в кровеносном русле (рис. 2). При этом механические воздействия, которым подвергаются клетки, оказывают благоприятное влияние на рост ткани. Таким образом, в биореакторе вырастает живой кровеносный сосуд, который затем имплантируют пациенту [7].

Рисунок 2. Биореактор для выращивания сосудов

Однако для того, чтобы вырастить орган, необходимо значительное время. Работая над проблемой создания протеза кровеносного сосуда, мы столкнулись с вопросом: что же делать в том случае, если пациент нуждается в срочном проведении операции, например аортокоронарном шунтировании, и не может ждать, пока его кровеносный сосуд вырастет? Чтобы ответить на этот вопрос и найти решение данной проблемы, мы обратились к одному из подходов тканевой инженерии, а именно выращиванию органов в организме пациента. Как же это возможно? Для этого матрица помещается в тот орган, часть которого необходимо восстановить. Таким образом, человеческий организм сам играет роль биореактора, и орган растет на матрице в благоприятной для него среде. Данный подход также предполагает использование матриц из биодеградируемого, то есть разрушаемого материала. Это необходимо для того, чтобы к моменту окончательного формирования органа материал матрицы полностью удалился из организма. Формирование органа, таким образом, возможно благодаря тому, что стволовые клетки организма способны мигрировать в зоны повреждения, где они активно делятся и осуществляют восстановление тканей.

И создал Господь Бог человека из праха земного…

Ветхий завет, Книга Бытия

Основываясь на данном подходе, нами был разработан сосудистый тканеинженерный графт, который имплантируется в ту область кровеносного русла, которая требует восстановления. В своей работе мы использовали синтетический полимер – поликапролактон. Поскольку известно, что синтетические полимеры более прочны по сравнению с природными, их чаще используют для изготовления тканеинженерных матриц. Поликапролактон известен высокой прочностью и эластичностью, а также тем, что его разрушение в организме происходит в течение длительного времени (более одного года) [8]. Считается, что этого времени должно быть достаточно для того, чтобы сформировался новый полноценный кровеносный сосуд.

Мы изготовили матрицы кровеносных сосудов из поликапролактона диаметром 2 мм (см. заглавный рисунок) с помощью метода электроспиннинга. Элетроспиннинг не имеет ничего общего с электрической удочкой и рыбалкой, а представляет собой метод создания очень тонких волокон из раствора полимера под действием электростатичесих сил. Материалы, получаемые данным методом, состоят из волокон, которые имеют микро- и наноразмеры [9].

Изготовленные матрицы состоят из волокон диаметром около 3 мкм, которые переплетаются между собой и образуют тем самым огромное количество пор (рис. 3). Такая структура материала очень нравится стволовым клеткам, которые способны проникать в стенку пористой матрицы и располагаться в порах как в нишах. Проникая в структуру матрицы, клетки активно делятся, растут и вырабатывают внеклеточное вещество, состоящее из коллагеновых и других волокон, которое впоследствии замещает полимерный материал [10].

Рисунок 3. Сканирующая электронная микроскопия матрицы из поликапролактона, изготовленной методом электроспиннинга

Проведя оценку механических свойств наших сосудистых матриц, мы смогли убедиться в том, что они не уступают по прочности и эластичности уже существующим синтетическим и биологическим протезам, которые используются в настоящее время в сердечно-сосудистой хирургии. А это значит, что после имплантации в кровеносное русло они смогут выдержать нагрузку, создаваемую током крови, и будут прекрасно выполнять свою функцию.

Так как сосудистые матрицы взаимодействуют непосредственно с кровью, очень важно, чтобы материал, из которого они изготовлены, не провоцировал образование тромбов. В противном случае образовавшиеся тромбы будут препятствовать току крови, что может привести к трагичным последствиям. В экспериментах с использованием донорской крови мы определили, что разрабатываемая матрица для восстановления кровеносного сосуда не вызывает образование тромбов, а значит, может быть имплантирована в кровеносное русло живого организма.

Однако для более полной оценки свойств сосудистых матриц их имплантировали в кровеносное русло крыс, а именно в брюшную часть аорты (рис. 4). В течение года мы наблюдали с помощью ультразвукового анализа, что имплантированная матрица проходима для крови. После чего матрицы извлекли из животных, и, оценивая их под световым микроскопом, обнаружили, что вся пористая стенка сплошь пронизана клетками, между которыми находится межклеточное вещество. Кроме того, вся внутренняя поверхность матрицы покрыта эндотелиальными клетками. Эти клетки формируют внутреннюю выстилку всех кровеносных сосудов. Все это свидетельствует о формировании на основе полимерной матрицы нового кровеносного сосуда.

Рисунок 4. Крыса линии Wistar после имплантации сосудистой матрицы

Проведенные нами исследования показывают, что в организме крысы такие сосудистые матрицы прекрасно функционируют и остаются проходимы в течение длительного времени (рис. 5). Однако человеческий организм слишком сильно отличается от организма крысы, в связи с чем необходимо проведение дальнейших исследований по усовершенствованию и тестированию матриц для регенерации кровеносных сосудов. Необходимо быть полностью уверенным, что матрицы абсолютно безопасны для здоровья человека. Используемый нами подход к выращиванию кровеносных сосудов направлен на то, чтобы исключить длительные и сложные этапы, связанные с получением клеток у пациента, увеличением их количества, а также культивированием на матрице в биореакторе. Это позволит очень быстро оказать помощь пациенту и значительно снизить затраты на выращивание органа. Стоимость тканеинженерных органов представляет собой одну из проблем тканевой инженерии, поскольку полное создание органа в биореакторе является очень дорогостоящей процедурой. Поэтому для того, чтобы тканеинженерные продукты были доступны для использования в медицинской практике, цена на них должна быть адекватной.

Рисунок 5. Компьютерная томография сосудистой матрицы, имплантированной в аорту крысе, через год после имплантации

В настоящее время в мире активно ведутся работы по выращиванию практически всех тканей и органов человеческого тела. Некоторые из них уже находятся в клиническом использовании, другие – еще на испытаниях и в разработке. Возможно, стремительный прогресс в области создания и восстановления поврежденных органов в скором времени приведет к широкому применению данной технологии в клинической практике и поможет продлить жизнь многим пациентам. А для некоторых больных тканеинженерные органы могут стать последней надеждой.

Исследование проведено при сотрудничестве Лаборатории клеточных технологий ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» СО РАМН, г. Кемерово, Россия (под руководством к.м.н. Алексея Сергеевича Головкина) и Cleveland VA Medical Center, Огайо, Кливленд, США (под руководством д.м.н. Якова Львовича Эльгудина).

1. Vacanti J.P. and Vacanti C.A. The history and scope of tissue engineering. In: Principles of tissue engineering (3rd Edition) / ed. by Lanza R.P., Langer R., and Vacanti J.P. Burlington: Elsevier, 2007. P. 3-6;
2. Ulrich Meyer, Jörg Handschel, Hans Peter Wiesmann, Thomas Meyer Fundamentals of Tissue Engineering and Regenerative Medicine – Springer Berlin Heidelberg, 2009;
3. Jennifer L. Olson, Anthony Atala, James J. Yoo. (2011). Tissue Engineering: Current Strategies and Future Directions. Chonnam Med J. 47, 1;
4. Anthony Atala, Stuart B Bauer, Shay Soker, James J Yoo, Alan B Retik. (2006). Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. The Lancet. 367, 1241-1246;
5. Hirotsugu Kurobe, Mark W. Maxfield, Christopher K. Breuer, Toshiharu Shinoka. (2012). Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. STEM CELLS Translational Medicine. 1, 566-571;
6. Тканевая инженерия – окно в современную медицину;
7. Xiaohui Zhang, Xiuli Wang, Vinny Keshav, Xiaoqin Wang, Jacqueline T. Johanas, et. al.. (2009). Dynamic culture conditions to generate silk-based tissue-engineered vascular grafts. Biomaterials. 30, 3213-3223;
8. N. Bölgen, Y. Z. Menceloğlu, K. Acatay, İ. Vargel, E. Pişkin. (2005). In vitro and in vivo degradation of non-woven materials made of poly(ε-caprolactone) nanofibers prepared by electrospinning under different conditions. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 16, 1537-1555;
9. Wee-Eong Teo, Ryuji Inai, Seeram Ramakrishna. (2011). Technological advances in electrospinning of nanofibers. Science and Technology of Advanced Materials. 12, 013002;
10. Wenguo Cui, Yue Zhou, Jiang Chang. (2010). Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Science and Technology of Advanced Materials. 11, 014108.

Источник